案例应用丨I.DOT助力高通量多平台分析方法的开发

加速并统一药物研发过程对于降低新药开发成本至关重要。多样化的化学和生物条件、专门的基础设施以及现有分析方法与高通量、纳升规模化学方法之间的不兼容性，使得整个药物研发过程漫长且成本高昂。在此，我们展示了一个结合了芯片上化学合成、表征和生物筛选的“chemBIOS”平台。我们开发了一种基于树状聚合物的表面图案技术，能够生成用于有机和水性液体的高密度纳米滴阵列。每个板（每块板上超过 50,000 个液滴）中的液滴可作为一个独立的、空间上分离的纳米容器，可用于溶液合成或分析测试。另外，一层铟锡氧化物涂层使该平台能够通过矩阵辅助激光解吸/电离质谱法实现超快的芯片内检测，精度可达每个液滴的阿托分子级别。该化学生物平台出色的光学特性使其能够在紫外、可见（芯片内紫外-可见光谱和光学显微镜）和红外（芯片内红外光谱）区域进行芯片内表征和原位反应监测。该平台与各种细胞生物筛选兼容，为高通量合成和药物发现领域开辟了新的途径。

图1 与 chemBIOS 平台兼容的化学、分析及生物高通量方法。chemBIOS 能实现基于芯片的溶液合成，以及使用各种光谱和光谱学方法在芯片上进行分析表征，用于高内涵筛选，同时还通过纳米滴阵列将化学与生物高通量筛选统一起来。

在本研究中，我们开发了一种基于树状聚合物的表面图案化方法，该方法源自现有的 chemBIOS 平台，旨在扩展其功能。这种方法可用于处理低表面张力液体（如有机溶剂）和高表面张力液体（如水溶液）的高密度纳米液滴阵列，从而实现广泛的化学、分析和生物应用（chemBIOS）（图 1）。铟锡氧化物（ITO）涂层使该平台具有导电性，因此能够与基于基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-TOF MS）的芯片级高通量化合物表征兼容。我们利用该平台展示了针对红外（IR）光谱的高灵敏度芯片式检测方法以及通过紫外-可见光谱进行的高含量反应监测技术（图 1）。开放式的基础设施和标准化格式使 chemBIOS 能够适用于成熟的实验和商业设备，同时也适用于高通量（每板超过 50,000 个液滴）和高含量（每实验超过 50，000 个结果）的化学、分析和生物筛选。

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图2 基于接枝聚硫醚树状大分子制造图案化树状大分子载片的过程。a 制备树状大分子载片始于将玻璃载片用三乙氧基乙烯基硅烷进行硅烷化处理，随后进行一系列重复步骤，包括两步反应。烯烃在光化学硫醇-烯烃点击反应中与 1-硫甘油发生反应，然后与 4-戊烯酸进行酯化反应。b 每个树状大分子代（G）的官能端基数量会增加 2n（n：重复次数），直到 G3 表面达到 8 个反应基团。c 通过光化学硫醇-烯烃反应制备具有高活性、含烯烃的树状大分子表面。无亲水边缘（红色）通过与全氟癸烷硫醇（PFDT）反应生成，随后 1-硫甘油（TG）形成亲水性斑点（绿色）。d 在亲水-亲油图案化载片上溶解不同化合物的纳米液滴阵列的照片。斑点直径：900 微米；亲水边缘宽度：225 微米；液滴体积：100 纳升；“规模”尺寸：1.8 毫米。

为了制备具有高和低表面张力液体的液滴阵列，疏水/疏油性图案应具有较大的前接触角，而亲水/亲油性部分则应具有极低的后接触角。我们假设，通过在高密度功能基团作用下对树状分子表面进行改性，可以增强润湿性特性的对比度，从而形成一种全亲水-全疏水的图案。树状分子表面改性基于 Killops 等人开发的高密度功能基团聚硫醚树状分子合成方法（图 2a）。将标准玻璃片用三乙氧基乙烯基硅烷进行硅烷化处理，以生成具有活性的乙烯基基团的表面。然后在重复的两步反应循环中合成树状分子层，该循环包括与 1-硫甘油反应的光化学硫烯点击反应，随后与 4-戊烯酸酯化（图 2b）；三个循环可生成装饰有高密度烯基的树状化表面。然后，该表面可以通过光化学方式分别与 1-硫甘油或 1H，1H，2H，2H-四氢呋喃酸进行功能化。利用洛罗德-辛卡硫醇（PFDT）可分别制得亲水性或疏水性的表面。通过使用石英光掩模依次进行功能化处理，可以制备出具有特定几何形状的全亲水或全疏水的微图案（图 2c）。

图 3 铟锡氧化物基底能够通过 MALDI-TOF 质谱分析和红外光谱分析实现芯片内表征。a 图示展示了通过 MALDI-TOF 质谱进行芯片内表征的过程。在导电、树状聚合物修饰且有图案化的铟锡氧化物（ITO）薄片上生成的化合物库，在进行 MALDI-TOF 分析之前可以进行处理并与基质溶液共结晶。b MALDI-TOF 质谱图，其中脂质体 1 的每个斑点分别为 2、0.3 和 0.1 道尔顿。斑点直径：500 微米；斑点间距：250 微米。MALDI-TOF 测量是在有图案化的 ITO 玻璃薄片上进行的。c 柱状图显示了不同大小斑点中脂质体 1 的芯片内质谱分析所获得的信噪比。数据基于三重实验得出，代表平均值±标准偏差；n = 3 独立实验。d 图示展示了通过红外光谱进行芯片内表征的过程。通过蒸发溶剂后进行的非侵入式芯片内化合物库红外光谱表征。e 芯片内对含有不同量脂质体 1 的多个斑点进行的红外成像。颜色标度：吸光度 [单位：个]。f 脂质体 1 的红外光谱（每个斑点 94.7 道尔顿）。斑点直径：500 微米；点距离：250 微米。

ITO涂层使化学生物传感器表面具有导电性，从而使其与MALDI-TOF MS兼容（图3a）。通过使用一个典型的脂质类化合物组来研究芯片内MALDI-TOF MS方法的灵敏度。对于尺寸越来越小的斑点（直径分别为900和500微米），观察到每个斑点的灵敏度都有所提高，最低可达atto摩尔级别（图3b、c）。较小斑点尺寸的更高灵敏度之间的协同作用使得芯片方法能够小型化，从而实现并行化。我们在微孔板中创建了一个纳米滴阵列，该阵列包含 50，400 个滴体（330×330 微米²的点；边框宽度：60 微米），这展示了进行超高通量筛选的可能性。此外，ITO 涂层的红外反射特性使得能够对化合物阵列进行红外成像，并对选定的化合物点进行芯片内红外光谱分析（图 3e、f）。

图 4 芯片内高通量反应监测。a 基于胺 A1、硫酯酮 T14 和吡啶二硫化物 PY12 的三组分脂质体合成反应方案。b 平行芯片内六十种脂质体合成的阵列布局。胺 A1 以不同浓度逐列分装在载玻片 A 上。含有不同比例硫酯酮 T14 与吡啶二硫化物 PY12 的混合物逐行分装在载玻片 B 上。所有反应均通过将两块载玻片重叠夹合的方式同时启动。c 重叠过程的示意性可视化以及由此产生的芯片内基于溶液的反应。最终的译文：这个具有紫外线吸收特性的副产物 2-噻吩酮能够通过紫外-可见光谱技术实现芯片内原位反应监测。通过三维绘图展示各反应条件下的反应半衰期（t1/2），展示了这种高通量系统在研究反应参数和反应机理方面所具有的强大能力。原始数据以“源数据文件”形式提供。

总结

这些结果为反应机制提供了见解，可用于反应优化。基于树状聚合物的表面改性结合了分区化、出色的光学性能（紫外-可见透明和红外反射）、化学耐受性（与有机溶剂兼容的玻璃基板）和导电材料特性，从而能够将重要的表征方法（用于化学和生物读出）结合起来，例如芯片上高灵敏度的质谱、芯片上光谱学以及芯片上（光学或潜在的电子）显微镜。这使得一种多功能的解决方案成为可能。平台。ChemBIOS 与多种贴壁细胞系（如 HeLa、HEK293T 和 Jurkat）以及悬浮细胞系兼容，因此适用于高通量细胞基筛选。ChemBIOS 结合了芯片上的高通量化学合成、高含量反应监测、高度灵敏的化合物表征以及生物筛选功能，从而将早期药物发现的所有领域统一起来。