案例应用丨I.DOT 精准操控赋能微滴阵列平台：无动物成分环境下高效维持干细胞多能性

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的体外培养长期依赖动物源性基质（如Matrigel），不仅存在异源污染风险，且传统培养体系因细胞用量大、高通量筛选效率低，严重制约其在再生医学和药物研发中的应用[1,2]。该文借助I.DOT非接触式纳米分配技术，与微滴阵列平台（DMA）深度结合，首次实现无Matrigel条件下hiPSCs的精准接种与高效培养，为干细胞研究提供“精准操控+微型化”的革命性工具。

实验方法

01I.DOT赋能的DMA平台核心技术

纳升级液滴精准分配：通过I.DOTOne分配器，将hiPSCs悬液以200nL/滴（单滴含约100个细胞）非接触式接种至DMA亲水斑点，细胞数变异系数（CV）<5%，避免传统移液的交叉污染（污染率<0.01%）。

打印压力动态优化：通过调节I.DOT分配压力（75/150/300 mbar·ms），控制细胞聚集体大小，150 mbar·ms压力下细胞团更稳定，存活率较75 mbar·ms提升42%，确保微滴内细胞黏附与增殖效率。

02无动物成分培养体系构建

非接触式操作规避污染：I.DOT精准分配Rock抑制剂（Y-27632）与培养基，在无Matrigel的TA/TBDMA表面形成独立微滴培养单元，单玻片集成672个亲水斑点，实现高通量平行培养。

多维度表征与功能验证：结合I.DOT的纳升级试剂分配能力，同步进行活死染色（CalceinAM/PI）、免疫荧光（Nanog/TRA-1-81）及qPCR检测，精准量化细胞活力与多能性基因表达。

实验结果

01细胞存活与微环境适配性

无Matrigel存活达70%-76%：I.DOT分配的200 nL微滴中（图1），hiPSCs形成紧密克隆团，核质比与形态均与Matrigel培养一致，证实I.DOT精准控制的微体积环境可替代动物基质支持细胞黏附（图2）。

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图1.实验表面特性与研究工作流程示意图

(A)本研究使用了两种市售表面，A型（TA）和B型（TB）。“TA和TB表面”是指用于培养2mL体积的hiPSC的大面积（2.5cm×7.5cm）亲水表面。“TA和TBDMA”是指含有分别具有TA和TB涂层的亲水性斑点阵列的DMA。DMA平台具有标准显微镜载玻片的尺寸，并且由在超疏水背景上的边长为1mm的方形亲水斑点阵列组成。在TA和TBDMA上以200nL体积培养细胞。(B)所执行研究的工作流程。作为第一步，使用水接触角（WCA）测角法、能量色散X射线光谱（EDX）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和X射线光电子能谱（XPS）表征TA和TB表面。。作为第二步，在TA和TB表面上的2mL培养基中以及在TA和TBDMA上的200 nL培养基中培养hiPSCs。作为第三步，研究了在不同表面上培养的hiPSCs的形态、活力和多能性。

图2.不同打印压力对细胞活力的影响

在通过ReLeSR™分离之前，将HiPSC在6孔板中的mTeSRplus培养基中培养。然后使用75、150和300mbarms的压力将分离的细胞分配到DMA点上，体积为200nL/点。将细胞在DMA载玻片上培养24h，然后加入钙黄绿素AM和PI进行活/死染色。细胞活力计算为钙黄绿素AM阳性面积与钙黄绿素AM和PI阳性面积之和的比率。(A)在TA上印刷并培养24小时的hiPSC的活力（n=3个生物学重复）。(B)接种到TADMA上并培养24小时的hiPSC的代表性荧光图像。比例尺：100μm。(C)打印到TBDMA上并培养24小时的hiPSC的活力（n=3个生物学重复）。(D)接种到TBDMA上并培养24小时的hiPSC的代表性荧光图像。数据表示平均SD。比例尺：100 μm。

高通量筛选效率跃升：单玻片日处理100+样本，试剂消耗较96孔板降低600倍，I.DOT的非接触式分配避免了手动操作误差，细胞活力检测变异系数（CV）仅3.2%，数据可靠性提升4倍。

02多能性标记物显著上调的 I.DOT 关键作用

Nanog表达提升5-7倍：I.DOT精准控制的微滴培养中，hiPSCs的多能性核心基因Nanog、Oct4、Sox2表达均显著高于2mL传统培养，无Matrigel组Nanog蛋白荧光强度仅比Matrigel组低15%（图3），揭示I.DOT介导的微体积效应协同表面特性维持干细胞未分化状态。

图3.不同打印压力对细胞活力的影响

在不同条件下培养的细胞的hiPSC多能性的比较。(A)对在MGB1表面上培养的hiPSC的Nanog表达的免疫荧光（IF）染色（MGC10，2 mL细胞培养基），MGC10DMA（MG培养基，200nL细胞培养基），MGTA表面（MGTA，2 mL细胞培养基），MGTB表面（MGTB，2mL细胞培养基）、MGTADMA（MG-TA，200nL细胞培养基）、MGTBDMA（MG-TA，200 nL细胞培养基）。细胞核用DAPI（蓝色）复染（n1/43个生物学重复）。比例尺：20 μm。(B)通过ImageJ测量每个实验组的NanogIF染色的平均荧光强度。随机选择每个实验组的三张图像并进行分析。数据表示平均SD。*P<0.05，2 mL和200 nL组之间的显著差异。(C)通过对从在不同表面和体积上培养的细胞分离的RNA进行qPCR分析来研究多能性特异性基因Nanog的表达（n/43个生物学重复）。将所有基因表达相对于参考基因GAPDH标准化，并表示为平均SEM。**P<0.01，2 mL和200 nL组之间的显著差异。

表面化学修饰的精准调控：通过I.DOT在含硫（TA）与含氟（TB）表面的差异化分配（图4），发现TB表面培养的hiPSCs Nanog表达略高，暗示I.DOT可结合表面化学特性，精准调控干细胞信号通路（如整合素-黏附分子通路）

图4. TA和TB表面的表征。

TA和TB表面的表征。(A)在环境条件（25℃）下，用8μL水滴测量亲水性TA和TB表面的水接触角（WCA）。数据代表平均SD（n¼3）。(B)TA和TB表面的能量色散X射线光谱（EDX）。表面涂有碳以确保导电性。在TA表面上检测到硫峰，在TB表面上检测到氟峰。(C)利用扫描电子显微镜观察了TA和TB的表面形貌，并对衬底不同位置上纳米Si晶粒进行了统计。比例尺：2μm。(D)采用原子力显微镜（AFM）对样品的表面形貌进行表征.表面粗糙度（Ra）由AFM高度轮廓（n¼3）确定。(E)测量了TA表面的扫描X射线光电子能谱（XPS），以及TA表面C1s和S2p的XPS谱。(F)测量了TB表面的扫描XPS谱，以及TB表面上C1s和F1s的XPS谱。

总结与讨论

I.DOT非接触式纳米分配技术作为DMA平台实现无Matrigel培养的核心驱动力，通过纳升级液滴的精准操控（200 nL/滴）与压力优化，在解决传统培养中动物成分依赖、样本浪费等瓶颈问题的同时，借助微体积效应与表面特性协同，显著提升hiPSCs多能性维持效率。该技术具备三大核心价值：一是精准操控，纳升级分配与压力参数优化确保细胞存活率和黏附效率，适配临床活检等稀缺原代细胞培养；二是高通量整合，单玻片672个独立微滴支持并行培养与药物筛选，试剂消耗较传统体系降低99%，加速新型培养基及小分子化合物的筛选进程；三是污染规避，非接触式分配污染率<0.01%，为临床级干细胞制备提供无外源干扰的洁净环境。

未来，I.DOT与DMA的协同创新将推动干细胞研究从“经验性培养”迈向“精准化操控”，结合3D生物打印与人工智能数据分析，有望构建高度模拟体内微环境的培养模型，为再生医学个性化治疗、药物毒性高通量筛选及罕见病建模等领域提供颠覆性技术支撑，开启精准医疗新维度。

参考文献

1. H. Park, K. Yang, M. Kim, J. Jang, M. Lee, D. Kim, H. Lee, S. Cho, Bio-inspired oligovitronectin-grafted surface for enhanced self-renewal and long-term maintenance of human pluripotent stem cells under feeder-free conditions, Biomaterials 50 (2015) 127–139.

2. E.A. Aisenbrey, W.L. Murphy, Synthetic alternatives to Matrigel, Nat. Rev. Mater. 5 (7) (2020) 539–551.